处理过程

barcode/UMI提取

根据read1的结构对barcode/UMI进行提取和处理，对read1和read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

  • barcode和UMI描述 以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。

    B: barcode部分碱基
    U: UMI部分碱基
    X: 其他任意碱基，用于占位

免疫分析产品的Read1结构为B17U12：
DD

数据流程

Barcode识别和矫正

根据结构设计，确定barcode所在序列位置，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

测序过程中，有一定几率发生测序错误。在提供有白名单的情况下，SeekSoulTools可以尝试barcode矫正。在启用矫正时，当无效barcode一个碱基错配（一个hamming distance）的序列存在于白名单中：

  • 只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；

  • 有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

经过上述处理后，数据指标包括：

  • total: 总共的reads数目

  • valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目

  • Q30 Bases in Barcode: barcode序列的q30比例

  • Q30 Bases in UMI: UMI序列的q30比例

  • Q30 Bases in R2 Read: reads2中q30比例

VDJ基因比例统计

根据ref构建STAR索引，并进行reads的比对，根据bam文件统计TRA、TRB、TRD或者IGK、IGL、IGH数目以及对应的比例

序列组装

1、利用trust4的fastq-extractor模块提取出可能包含TCR/BCR序列的reads,然后对每个barcode进行downsample，超过80000条reads的细胞只取前80000条reads。
2、按照barcode，过滤掉支持reads小于n50的umi，然后用umitools对umi进行矫正。
3、基于上述reads用trust4进行组装。
trust4详细说明请参考trust4

VDJ注释

利用trust4的annotator进行VDJC基因及CDR3位置的注释。对于一个细胞内一条链有多种注释的情况，选取umi数值最高的contig作为primary_chain。umi数值是根据每个contig的reads信息统计得到的，在计数之前进行一步过滤:当同一个umi被用于多个contig组装时，对这些contig按照reads降序排列，reads数目第二高的contig/最高的contig比例小于0.15时，该umi只被最高contig计数，其他不进行该umi的计数。

clonotype计算

1、挑选符合chain要求的contig; 过滤掉1-umi/reads小于0.94的contig; 过滤掉contig支持的umi之和小于3的细胞。
2、如果有提供5’matrix信息，细胞barcode取交集。
3、利用dandelion基于CDR3 氨基酸序列相似性判定克隆，相似性阈值：BCR设定85%，TCR设定100%。详细条件可参考：sc-dandelion
4、对于只包含单链的克隆型，找到与之共享VJ基因以及CDR3氨基酸序列的其他所有contig，以这些contig umi的n50的1%作为阈值，如果该单链umi小于这个阈值，则丢弃。
5、对于保留下来的单链克隆型，找到与之共享VJ基因以及CDR3氨基酸序列的所有双链克隆型，按照细胞数进行排序，如果第二大size的双链克隆型与最大size的双链克隆型细胞数目之比小于0.15，将该单链克隆型合并进最大size的双链克隆型，否则不进行合并。
6、按照新的克隆型，根据细胞数排序，生成新的clone id，并给出exact id。