处理过程

step1: barcode/UMI提取

SeekSoulTools根据Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

barcode和UMI描述以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。

B: barcode部分碱基
U: UMI部分碱基
X: 其他任意碱基，用于占位

全序列产品的Read1结构为B17U12：

根据结构设计，确定barcode所在序列位置，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

测序过程中，有一定几率发生测序错误。在提供有白名单的情况下，SeekSoulTools可以尝试barcode矫正。在启用矫正时，当无效barcode一个碱基错配（一个hamming distance）的序列存在于白名单中：

在建库时可能引入的接头或者TSO等序列，我们对这些污染序列进行切除，剪切完的read1和read2长度需要大于设定的最小长度来保证有足够的信息，准确比对到基因组的位置。如果剪切完成后的read1或read2长度小于最小长度，我们认为这条read为无效read。

经过上述处理后，数据指标包括：

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

使用STAR比对软件将处理后的reads1和reads2提取8Mreads比对到核糖体的参考基因组上，用featureCounts将比对上的read定位到基因上，并统计数据中rRNA和Mt_rRNA比例。
使用STAR比对软件将处理后的reads1和reads2比对到参考基因组上。
根据gtf文件找到housekeeping基因ACTB的所有exon位置，并从bam中统计覆盖到超过0.2倍ACTB平均深度的区间的比例。
根据gtf文件，将全部转录本exon区间转成bed格式，并随机抽出10000个转录本的区间进行genebody绘制。
使用QualiMap软件和转录本注释文件GTF，统计reads比对外显子、内含子和基因间区等的比例。
使用featureCounts将比对上的read注释到基因上，可以选择不同的注释规则，如链方向性和定量的feature。当使用外显子定量时，当read>超过50%碱基比对到外显子区域时，认为该read来源于此外显子以及外显子对应的基因；当使用转录本定量时，当read超过50%碱基比对到转录本区域时，认为该read来源于此转录本以及转录本对应的基因。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Reads Mapped to Genome: 比对到参考基因组上的reads占所有reads的比例（包括只有一个比对位置和多个比对位置的reads）
Reads Mapped to Middle Genebody：在genebody中，覆盖转录本的25%-75%区间的比例。
Reads Mapped Confidently to Genome: 在参考基因组上只有一个比对位置的reads占所有reads的比例
Fraction over 0.2 mean coverage depth of ACTB gene：超过ACTB基因平均覆盖深度0.2x区间占ACTB基因长度的比例。
rRNA% in Mapped：数据中核糖体基因的占比。
Mt_rRNA% in Mapped：数据中线粒体核糖体基因的占比。
Reads Mapped to Intergenic Regions：比对到基因间隔区reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intronic Regions：比对到内含子reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Exonic Regions：比对到外显子reads占所有reads的比例

SeekSoulTools以barcode为单位提取featureCounts输出的bam数据，统计注释到基因的UMI和UMI对应的reads数：

测序过程中，UMI也有一定概几率出现测序错误。SeekSoulTools默认使用UMI-tools的adjacency方法对UMI进行矫正。

Schematic from UMI-tools 图片来源: https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/the_methods.html

在一个细胞群中，我们认为细胞和细胞的mRNA的含量不会相差太多。如果一个barcode对应的mRNA的含量很低，我们认为这个barcode的磁珠并没有捕获细胞，mRNA来源于背景。 SeekSoulTools会以上面的规则，进行barcode是否为细胞的判定。有以下几个步骤：

对所有barcode按照对应的UMI数由高到低排序；
取预估细胞的1%位置的barcode的UMI数除以10为阈值；
barcode的UMI数大于阈值的判定为细胞；
barocde的UMI小于阈值，但大于300时，使用DropletUtils分析。DropletUtils方法先假设UMI数量低于100的barcode为empty droplet，然后根据每个droplet相同基因的UMI数总和为背景RNA表达谱中该基因UMI数目，进而得到基因UMI数目的期望值。再通过将每个barcode的UMI数进行统计学检验，显著差异的为细胞；
不符合上述条件的为背景。

经过上述处理后，有如下数据指标：

经过上述定量，得到表达矩阵后，我们可以进行下一步的分析。

使用Seurat计算线粒体含量，细胞中UMI总数，细胞中基因总数。之后对矩阵进行归一化、寻找高变基因、降维聚类之后寻找差异基因。