处理过程

step1: barcode/UMI提取

SeekSoulTools根据不同的Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

  • barcode和UMI描述 以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。

    B: barcode部分碱基
    L: linker部分碱基
    U: UMI部分碱基
    X: 其他任意碱基，用于占位

    以下面两种Read1结构为例：
    B8L8B8L10B8U8： MM0

    B17U12： DD

  • 错位设计的Anchor定位 MM设计下，为了增加Linker部分在测序时碱基均衡性，加入了1-4 bp的移码碱基，即anchor，anchor决定了barcode的起始位置。 MM

数据流程

确定anchor

对于Read1有错位设计的数据（MM试剂产出的数据），SeekSoulTools尝试在Read1序列前7个碱基中寻找anchor序列，以确定后续barcode等的起始。若没找到anchor序列，此条read以及对应的R2被认为是无效read。

Barcode和Linker矫正

在确定barcode的起始后，根据结构设计，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

测序过程中，有一定几率发生测序错误。在提供有白名单的情况下，SeekSoulTools可以尝试barcode矫正。在启用矫正时，当无效barcode一个碱基错配（一个hamming distance）的序列存在于白名单中：

  • 只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；

  • 有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

Linker的处理与Barcode相同。

接头和PolyA序列剪切

在转录组产品中，Read2的末端有可能会出现polyA tail，建库时可能引入的接头序列。我们对这些污染序列进行切除，剪切完的read1和read2长度需要大于设定的最小长度来保证有足够的信息，准确比对到基因组的位置。如果剪切完成后的read1或read2长度小于最小长度，我们认为这条read为无效read。

经过上述处理后，数据组成如下图：

step1

  • total: 总共的reads数目

  • valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目

  • B_corrected: 矫正成功的reads数目

  • B_no_correction: 错误Barcode的reads数目

  • L_no_correction: 错误Linker的reads数目

  • no_anchor：不包含anchor的reads数目

  • trimmed: 进行过剪切的reads数目

  • too_short: 进行过剪切后长度小于60bp的reads数目

指标之间的关系如下：

total = valid + no_anchor + B_no_correction + L_no_correction

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

step2: 进行比对并找到比对基因

序列比对

  • 使用STAR比对软件将处理后的R2比对到参考基因组上。

  • 使用QualiMap软件和转录本注释文件GTF，统计reads比对外显子、内含子和基因间区等的比例。

  • 使用featureCounts将比对上的read注释到基因上，可以选择不同的注释规则，如链方向性和定量的feature。当使用外显子定量时，当read>超过50%碱基比对到外显子区域时，认为该read来源于此外显子以及外显子对应的基因；当使用转录本定量时，当read超过50%碱基比对到转录本区域时，认为该read来源于此转录本以及转录本对应的基因。

经过上述处理后，有如下数据指标：

  • Reads Mapped to Genome: 比对到参考基因组上的reads占所有reads的比例（包括只有一个比对位置和多个比对位置的reads）

  • Reads Mapped Confidently to Genome: 在参考基因组上只有一个比对位置的reads占所有reads的比例

  • Reads Mapped to Intergenic Regions：比对到基因间隔区reads占所有reads的比例

  • Reads Mapped to Intronic Regions：比对到内含子reads占所有reads的比例

  • Reads Mapped to Exonic Regions：比对到外显子reads占所有reads的比例

step3: 定量

UMI定量

SeekSoulTools以barcode为单位提取featureCounts输出的bam数据，统计注释到基因的UMI和UMI对应的reads数：

  • 过滤掉对应UMI为单个重复碱基的reads， 例如UMI为TTTTTTTT

  • 当read注释到多个基因，在有唯一外显子的注释时，为有效read，其他情形下都过滤掉

UMI矫正

测序过程中，UMI也有一定概几率出现测序错误。SeekSoulTools默认使用UMI-tools的adjacency方法对UMI进行矫正。

Schematic from UMI-tools 图片来源: https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/the_methods.html

细胞判定

在一个细胞群中，我们认为细胞和细胞的mRNA的含量不会相差太多。如果一个barcode对应的mRNA的含量很低，我们认为这个barcode的磁珠并没有捕获细胞，mRNA来源于背景。 SeekSoulTools会以上面的规则，进行barcode是否为细胞的判定。有以下几个步骤：

  • 对所有barcode按照对应的UMI数由高到低排序；

  • 取预估细胞的1%位置的barcode的UMI数除以10为阈值；

  • barcode的UMI数大于阈值的判定为细胞；

  • barocde的UMI小于阈值，但大于300时，使用DropletUtils分析。DropletUtils方法先假设UMI数量低于100的barcode为empty droplet，然后根据每个droplet相同基因的UMI数总和为背景RNA表达谱中该基因UMI数目，进而得到基因UMI数目的期望值。再通过将每个barcode的UMI数进行统计学检验，显著差异的为细胞；

  • 不符合上述条件的为背景。

经过上述处理后，有如下数据指标：

  • Estimated Number of Cells: 算法判定的细胞总数

  • Fraction Reads in Cells: 判定为细胞的reads占所有参与定量的reads的比例

  • Mean Reads per Cell: 细胞的平均reads数，总reads数/判定的细胞数

  • Median Genes per Cell: 判定为细胞的barcode中基因数的中位数

  • Median UMI Counts per Cell: 判定为细胞的barcode中UMI数的中位数

  • Total Genes Detected: 所有细胞检测到基因数量

  • Sequencing Saturation: 饱和度，1 - UMI总数/reads总数

step4: 后续分析

经过上述定量，得到表达矩阵后，我们可以进行下一步的分析。

Seurat分析流程

使用Seurat计算线粒体含量，细胞中UMI总数，细胞中基因总数。之后对矩阵进行归一化、寻找高变基因、降维聚类之后寻找差异基因。